Laboratórios que não podem pagar microscópios caros de super-resolução poderiam usar uma nova técnica de expansão para criar imagens de estruturas em nanoescala dentro das células.
Uma maneira clássica de criar imagens de estruturas em nanoescala nas células é com microscópios caros e de alta resolução. Como alternativa, os pesquisadores do MIT desenvolveram uma maneira de expandir o tecido antes de imagiá-lo – uma técnica que lhes permite obter resolução em nanoescala com um microscópio óptico convencional.
Na versão mais recente dessa técnica, os pesquisadores tornaram possível expandir o tecido em 20 vezes em uma única etapa. Este método simples e barato pode abrir caminho para quase qualquer laboratório de biologia realizar imagens em nanoescala.
“Isso democratiza a imagem”, diz Laura Kiessling, professora de química da Novartis no MIT e membro do Broad Institute do MIT e Harvard e do Koch Institute for Integrative Cancer Research do MIT. “Sem esse método, se você quiser ver coisas com alta resolução, terá que usar microscópios muito caros. O que essa nova técnica permite é ver coisas que normalmente não conseguiríamos ver com microscópios padrão. Ela diminui o custo da imagem porque você pode ver coisas em nanoescala sem a necessidade de instalações especializadas.”
Na resolução alcançada por essa técnica, que gira em torno de 20 nanômetros, os cientistas conseguem observar organelas no interior das células, além de aglomerados de proteínas.
“A expansão de vinte vezes leva você ao reino em que as moléculas biológicas operam. Os blocos de construção da vida são coisas em nanoescala: biomoléculas, genes e produtos genéticos”, diz Edward Boyden, professor de neurotecnologia Y. Eva Tan no MIT; professor de engenharia biológica, artes e ciências da mídia e ciências cerebrais e cognitivas; um investigador do Howard Hughes Medical Institute; e membro do Instituto McGovern de Pesquisa do Cérebro do MIT e do Instituto Koch de Pesquisa Integrativa do Câncer.
Boyden e Kiessling são os autores seniores do novo estudo, que aparece hoje em Métodos da Natureza. O estudante de pós-graduação do MIT Shiwei Wang e Tay Won Shin PhD ’23 são os principais autores do artigo.
Uma única expansão
O laboratório de Boyden inventou a microscopia de expansão em 2015. A técnica requer a incorporação de tecido em um polímero absorvente e a quebra das proteínas que normalmente mantêm o tecido unido. Quando água é adicionada, o gel incha e separa as biomoléculas umas das outras.
A versão original dessa técnica, que expandiu o tecido cerca de quatro vezes, permitiu aos pesquisadores obter imagens com resolução em torno de 70 nanômetros. Em 2017, o laboratório de Boyden modificou o processo para incluir uma segunda etapa de expansão, alcançando uma expansão geral de 20 vezes. Isso permite uma resolução ainda maior, mas o processo é mais complicado.
“Desenvolvemos diversas tecnologias de expansão de 20 vezes no passado, mas elas exigem múltiplas etapas de expansão”, diz Boyden. “Se você pudesse fazer essa expansão em uma única etapa, isso poderia simplificar um pouco as coisas.”
Com uma expansão de 20 vezes, os pesquisadores podem chegar a uma resolução de cerca de 20 nanômetros, usando um microscópio óptico convencional. Isto permite-lhes ver estruturas celulares como microtúbulos e mitocôndrias, bem como aglomerados de proteínas.
No novo estudo, os pesquisadores decidiram realizar uma expansão de 20 vezes com apenas uma única etapa. Isso significava que eles precisavam encontrar um gel que fosse extremamente absorvente e mecanicamente estável, para que não se desfizesse quando expandido 20 vezes.
Para isso, utilizaram um gel montado a partir de N,N-dimetilacrilamida (DMAA) e acrilato de sódio. Ao contrário dos géis de expansão anteriores que dependem da adição de outra molécula para formar ligações cruzadas entre as cadeias de polímero, este gel forma ligações cruzadas espontaneamente e exibe fortes propriedades mecânicas. Tais componentes de gel já haviam sido usados em protocolos de microscopia de expansão, mas os géis resultantes poderiam expandir apenas cerca de dez vezes. A equipe do MIT otimizou o gel e o processo de polimerização para torná-lo mais robusto e permitir uma expansão de 20 vezes.
Para estabilizar ainda mais o gel e aumentar a sua reprodutibilidade, os pesquisadores removeram o oxigênio da solução polimérica antes da gelificação, o que evita reações colaterais que interferem na reticulação. Esta etapa requer a passagem de gás nitrogênio pela solução de polímero, que substitui a maior parte do oxigênio do sistema.
Uma vez formado o gel, as ligações selecionadas nas proteínas que mantêm o tecido unido são quebradas e água é adicionada para fazer o gel se expandir. Após a expansão ser realizada, as proteínas alvo no tecido podem ser rotuladas e visualizadas.
“Esta abordagem pode exigir mais preparação da amostra em comparação com outras técnicas de super-resolução, mas é muito mais simples quando se trata do processo de imagem real, especialmente para imagens 3D”, diz Shin. “Documentamos o protocolo passo a passo no manuscrito para que os leitores possam analisá-lo facilmente.”
Imagens de estruturas minúsculas
Usando esta técnica, os pesquisadores conseguiram criar imagens de muitas estruturas minúsculas dentro das células cerebrais, incluindo estruturas chamadas nanocolunas sinápticas. São aglomerados de proteínas dispostas de maneira específica nas sinapses neuronais, permitindo que os neurônios se comuniquem entre si por meio da secreção de neurotransmissores como a dopamina.
Em estudos de células cancerígenas, os pesquisadores também criaram imagens de microtúbulos – tubos ocos que ajudam a dar estrutura às células e desempenham papéis importantes na divisão celular. Eles também foram capazes de ver mitocôndrias (organelas que geram energia) e até mesmo a organização de complexos de poros nucleares individuais (aglomerados de proteínas que controlam o acesso ao núcleo da célula).
Wang agora está usando essa técnica para visualizar carboidratos conhecidos como glicanos, que são encontrados nas superfícies celulares e ajudam a controlar as interações das células com seu ambiente. Este método também poderia ser usado para criar imagens de células tumorais, permitindo aos cientistas vislumbrar como as proteínas estão organizadas dentro dessas células, muito mais facilmente do que era possível anteriormente.
Os pesquisadores imaginam que qualquer laboratório de biologia deve ser capaz de usar essa técnica a um custo baixo, uma vez que depende de produtos químicos padrão e de prateleira e de equipamentos comuns, como microscópios confocal e porta-luvas, que a maioria dos laboratórios já possui ou pode acessar facilmente.
“Nossa esperança é que, com esta nova tecnologia, qualquer laboratório de biologia convencional possa usar este protocolo com seus microscópios existentes, permitindo-lhes chegar a uma resolução que só pode ser alcançada com microscópios de última geração, muito especializados e caros”, diz Wang. .